293、293T、293FT 、293A的区别和培养攻略-技术前沿-资讯-生物在线

293、293T、293FT 、293A的区别和培养攻略

作者:上海中乔新舟生物科技有限公司 2022-05-20T14:51 (访问量:21808)

我们可能都有过这样的顾虑,人胚肾细胞为何有这么多名字?他们都有什么区别?我们该如何选择?本期给大家总结这四个细胞的区别和培养细节吧!


背景

HEK-293人胚肾细胞:是用5型腺病毒75株系转化,含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系,是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster UniversityF.L.GrahamJ.S.Miley1976年用DNA转染技术构建而成。该细胞为人类腺病毒载体扩增的宿主。可表达异常的玻连蛋白的细胞表面受体,由整合素β1亚单位和玻连蛋白受体α-v亚单位组成。

HEK-293T人胚肾细胞:人胚肾细胞293细胞插入SV40 T-抗原基因后产生的高转染效率的衍生株称为293T。该细胞最初的名字是293tsA1609neo,携带SV40复制序列,被广泛用于逆转录病毒生产、基因表达和蛋白表达。

HEK-293FT人胚肾细胞:该细胞稳定表达SV40大T抗原,并且促进最适病毒产物的产生。293FT细胞能制造高滴度的慢病毒。

293A人胚肾细胞:细胞来源于人肾纤维母细胞,组成性表达 E1A 和 E1B 蛋白。

从背景知识我们应该知道怎么选择所需求的细胞了吧!

形态

293T

人胚肾细胞

人胚肾细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于人胚肾细胞细胞的大规模培养。

人胚肾细胞培养特性

大家都知道人胚肾细胞在运输、高密度、偏碱性环境、低温等情况下很容易漂浮脱落。如果您是购买的复苏好的培养瓶,收到货时可能会是这样的:

1遇到这样该怎么处理?

1、建议收到细胞后放培养箱静止2h-4h后观察细胞是否再次恢复贴壁;

2、如果贴壁可去除培养基轻柔pbs洗一次后,加入Trypsin作用30s-60s镜下观察细胞变圆,就可加DMEM完全培养基终止消化,吹打4-6次至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞会贴壁;

3、如果细胞没有恢复贴壁,可以收集培养瓶内液体离心1000转5min收集细胞,接种到新培养瓶,添加新鲜的完全培养基,T25培养瓶建议加7ml完全培养基;

4必要时加使用多聚赖氨酸、纤连蛋白进行包被,促进细胞的延展和贴壁;

2培养过程中的小细节:

1. 人胚肾细胞生长快速,当细胞传代时机为达80-90%汇合,传代比例建议为1:3;

2. 一般来讲,1:10传代后,一周可以长满。严禁高密度过度生长。不然会导致细胞密度加大和堆积消化后不分散;

3. 人胚肾细胞生长贴壁不牢固,观察时间长后容易飘浮,建议观察后立即进行处理或放入培养箱,换液时建议预热完全培养基;

4. 人胚肾细胞在低代数时容易贴壁,生长良好,在传到几十代以后,易聚集成团,且贴壁不牢,用PBS冲洗时即可能脱落,即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液,最好购入时先大量冻存;

5. 人胚肾细胞生长明显适应酸性环境,pH值在6.9~7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基;

6. 人胚肾细胞复苏时贴壁很慢,复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热;

3转染小攻略

1、建议使用10代内的细胞进行包转染;

2、体外应用293细胞进行细胞转染时,如果是采用磷酸钙转染、慢病毒包毒液时,一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘,高密度细胞加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落,最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染,可以避免细胞的大量脱落;

3、慢病毒感染后可收取两次病毒液,48H建议用正常血清浓度培养收毒,72h时建议使用低浓度血清进行培养,这样收的毒液滴度大大增加;

4、必要时候用大瓶培养比小瓶要好,这样有利于293均匀的分布,利于营养的摄取,病毒颗粒的释放;

我司提供慢病毒构建的稳转株服务使用的是293FT细胞,该细胞转染效率高、慢病毒滴度高,有效运用于细胞系的红色、绿色、LUC等细胞系的标记。

PC-3-GFP标记


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