复杂的石蜡制片，繁琐的脱蜡染色让实验的菜鸟们对免疫组化实验望而却步。每每做IHC时，每一步都小心翼翼，精益求精，等待扫描结果时，内心总是独白：“你已经是一个成熟而完美的切片了，该展示你的精彩了”。但理想是美好的，现实是骨感的，总会遇到各种“疑难杂症”，实验还是得继续摸索。究竟如何得到完美的免疫组化实验结果，索莱宝为您归纳总结了一些常见问题和实验小技巧。

     免疫组化（IHC）知识大讲堂       

石蜡切片在染色过程中出现脱片现象怎么回事？

1）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；

2）烤片时间不够，或温度不够，可以适当延长烤片时间和提高烤片温度；

3）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等；

4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水；

5）展片没有展开，捞片时有气泡；

6）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。用含有多聚赖氨酸的玻片有助于粘附，索莱宝提供了多聚赖氨酸粘附载玻片。

组织切片为什么产生非特异性染色？

1）标本染色过程中干片会导致非特异性着色；

2）PBS冲洗不充分，残留抗体会增强着色，应注重洗涤过程；

3）抗体孵育时间过长、抗体浓度高也易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。使用索莱宝推荐的稀释比例对抗体进行稀释。多克隆抗体易出现非特异性着色，也可以试用索莱宝的单克隆抗体；

4）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

5）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

6）DAB孵育时间过长或浓度过高。

为什么免疫组化染色呈阴性结果？

1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；

2）抗原修复不全。若微波效果不佳，还可高压修复；

3）组织切片本身这种抗原含量低；

4）血清封闭时间过长；

5）DAB孵育时间过短；

6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；

7）建议首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

为什么背景高？

1）考虑一抗浓度高；

2）调整DAB孵育时间；

3）也要考虑血清封闭时间是否过短；

4）适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

边缘效应怎么办？

1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

DAB显色后发现切片着色不均匀？

1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一；

2）有可能是你的显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致；

3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你组化笔圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。

     免疫组化（IHC）的TIPS       

• 组织固定越新鲜越好，尽快固定，多选用4%多聚甲醛固定液。但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液；
• 组织脱水和透明时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整；
• 切片展片时有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇；
• 烤片：要控制烤片的温度和时间，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。烤片的时候把切片呈60°角斜立，切片和载玻片之间的水滴或气泡会从边缘滑出，减少对切片的损坏；
• 蜡块及切片的保存：最好在4℃保存；
• 脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡3min，晾干，即可进行下一步；
• 灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活；
• 暴露抗原：对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等；
• 封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭；
• 抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用；
• 背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗；
• 显色：DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
• 返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝；
• 整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

此刻，相信您不会做不好啦

可是，但是，还是做不好怎么办

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