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15min不一定能追到一个女朋友,但一定可以完成一次克隆!

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2022-08-12T13:37 (访问量:8058)

15min不一定能追到一个女朋友,但一定可以完成一次克隆!

——Yeasen Hieff Clone® 一步法克隆试剂盒荣登《Cell》《Science》等国际顶尖期刊


提起“分子克隆”或“载体构建”这两个词,大家可能先想到的是传统酶切酶连法,即用限制性内切酶产生黏性末端,通过T4 DNA连接酶连接两个片段的克隆方法。该方法存在着一些明显的局限,如连接反应时间长,操作繁琐,克隆效率低,酶切位点的选择易受到限制等。

为了提高克隆效率,节省反应时间,基于同源重组酶的无缝克隆技术应用而生。与传统酶切酶连技术相比,无缝克隆技术操作简单快速,不受到酶切位点的限制,可一次进行多个片段的拼接,大大的提高了克隆效率。

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翌圣生物在成熟的工具酶表达纯化平台基础上,获得高纯度重组酶,并反复优化重组酶反应微环境,研发出Hieff Clone®系列无缝克隆试剂盒。

Hieff Clone®克隆试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点,可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化,并在插入片段正、反向PCR引物5'端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5'和3'末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下,最快仅需反应5分钟即可用于后续转化,完成定向克隆,克隆阳性率可达95%以上。

产品优势

● 无需考虑酶切位点:不受插入片段酶切位点的限制,适用于任何载体;插入片段兼容粘性或平末端。

● 设计简单:在插入片段的PCR扩增引物5'端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

● 快速高效:50℃,最快5分钟即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

● 应用广泛:可用于单片段或多片段定向克隆,高效克隆50 bp-10 kb片段;也可结合Canace高保真酶,应用于定点突变。

实验操作流程

①线性化载体的制备:酶切或PCR制备线性化载体

②插入片段的制备:在目的DN**段上下游引物的5'端引入15-25 bp左右载体末端同源序列;PCR反应扩增目的片段。

③重组反应:按比例混合线性化载体和目的DN**段进行重组,50℃反应5-20 min。

④转化、涂板:将重组产物直接转化后涂平板,阳性克隆鉴定。


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图1:Hieff Clone®一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。

实验数据

★单片段高效重组(Cat# 10911)

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图2:Hieff Clone® One Step Cloning Kit(Cat# 10911)可以有效克隆不同长度的单片段基因。

A-D:重组转化平板。E:插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H:插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体:pFastBac1,4.7 kb,插入片段大小分别是1.2 kb,3 kb和5 kb,载体与插入片段摩尔比:1:3,重组反应条件:50℃,20 min。

★多片段轻松重组(Cat# 10912)

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图3:Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit(Cat# 10912)进行三片段克隆。

A:重组转化平板。B:插入片段和载体浓度检测电泳图。C:PCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体:pCAMIBA1302,10 kb,三个插入片段长度:1 kb,1.5 kb和2.5 kb,重组反应条件:50℃,20 min。

★单片段、五片段高效重组(Cat# 10922

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图4:Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit(Cat# 10922)可保证单片段、多片段高效克隆。

A-B:重组转化平板。C:插入片段PCR鉴定电泳图。载体:pGEX4T-1, 5 kb,插入片段长度:2 kb,摩尔比为1:3,重组反应条件:50℃,5 min。E-F:重组转化平板。G:插入片段PCR鉴定电泳图。载体:pGEX4T-1, 5 kb,五个插入片段:0.5 kb, 0.5 kb,0.5 kb,0.5 kb和1 kb,重组反应条件:50℃,30 min。

客户反馈

◆ 长片段重组

实验信息:载体大小:8000 bp,目的片段大小:7500 bp。

实验数据:

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图5:使用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit进行克隆。

A:阴性对照转化平板。B:重组质粒转化平板。C:载体和目的片段的浓度检测电泳图。D:菌落PCR鉴定电泳图,箭头指示目的条带。 M1:Marker Ⅲ;M2:100 bp DNA ladder。(仁济医院)

◆ 多片段重组

实验信息:载体大小:3996 bp;四个片段大小:576 bp,867 bp,915 bp和647 bp。

实验数据:

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图6:使用Hieff Clone® Multi One Step Cloning Kit进行克隆。

A:重组质粒转化平板。B:1为载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图。C:菌落PCR验证结果,其中1为原始质粒对照电泳,2-5为重组质粒,仅检测863bp的一个目的片段,6为假阳性。D:阳性克隆测序结果。M:Marker II。(微生物所)

FAQ

Q:Hieff Clone®克隆的原理是什么?

A:利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DN**段快速定向克隆。

Q:与传统克隆相比,Hieff Clone®克隆有什么优势?

A: 1)无需考虑酶切位点:不受插入片段酶切位点的限制,适用于任何载体;插入片段兼容粘性或平末端。

2)设计简单:在插入片段的PCR扩增引物5'端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

3)快速高效:50℃,20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

4)应用广泛:可用于单片段或多片段定向克隆,也可结合Canace高保真酶,应用于定点突变。

Q:同源序列长度对重组效率的影响?

A:同源序列的长度与克隆数目有相关性,一般同源片段选择在20 bp左右,可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。

Q:线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗?

A:线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应,建议割胶回收纯化产物。

Q:一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗?

A:推荐使用转化效率为108 cfu/μg的感受态细胞。如Yeasen的DH5α(cat NO. 11802ES),TOP10(cat NO. 11801ES)等。

Q:线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例?

A:载体使用量应大于0.01 pmol,推荐使用量0.03 pmol;克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内,最适为1:2-1:3,超过范围可能会影响克隆效率。

Q:一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些?

A:本试剂盒适用于绝大多数基于常规“酶切-连接”方法的克隆实验,并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。

Q:多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗?

A:多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是,单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆,重组效率可能会受到影响。

Q:一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃,是否可以在37℃进行反应?

A:一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构,同时是Hieff Clone®重组酶的最适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应,请根据实验需要进行优化。


部分发表文献

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