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如何获取高完整性、低dsRNA的saRNA?速速点击查看!

作者:苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 2024-11-15T00:00 (访问量:4468)

自2023年11月,第一款自复制RNA(self-amplifying RNA, saRNA)疫苗在日本获批上市以来,以saRNA技术路线为基础的传染病疫苗或肿瘤治疗性疫苗已有多个项目开启了临床之路。saRNA模拟病毒复制模式,进入细胞后进行自我复制,从而在较低注射剂量的情况下,实现抗原的高表达,进而产生较强的免疫反应。

saRNA结构与复制原理

An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vaccines (Basel). 2021

saRNA正链RNA分子,进入细胞后,翻译组装形成RNA复制酶复合物(Rep)。一方面,Rep利用saRNA合成saRNA负链,再以负链为模板合成新的saRNA拷贝,实现saRNA的自扩增。同时,Rep合成大量目的基因RNA,目的基因RNA翻译出大量蛋白分子。

 

saRNA合成全流程解决方案
01 模板制备

在该环节中,高质量的质粒制备尤为重要,关系到后续体外转录产物的质量。环状质粒由于无有效的终止,会转录出不同长度的RNA产物。为了得到特定长度的RNA,质粒必须完全线性化,线性化的质粒需确保双链为平末端或5’端为突出结构。近岸蛋白提供GMP级限制性内切酶BsaI(目录号:GMP-RE026/GMP-RE036)、BspQI(目录号:GMP-RE057)、XbaI(目录号:GMP-RE015)以及无动物源性PmeI(目录号:RE106),高效实现质粒线性化。

 

02 体外转录

T7 RNA Polymerase是体外转录生产治疗用mRNA的关键酶。saRNA因添加了复制酶序列,导致其长度过长,通常会大于8Knt长度,因此其转录难度增大,很难保证较好的完整性。同时因为序列长,dsRNA副产物也成为saRNA工艺的巨大难题。此时,一款可以显著降低dsRNA杂质,并且其他性能兼具的T7 RNA聚合酶成为关键点。近岸蛋白经分子进化改造获得的T7 RNA聚合酶突变体(目录号:GMP-E122)可显著降低转录产物中dsRNA杂质。

 

产品特点:

·显著降低dsRNA含量——增效

·帽结构添加量可低至1mM——降本

·全能型选手

·兼容saRNA长片段模板

RNase Inhibitor(目录号:GMP-E125)和无机焦磷酸酶(目录号:GMP-M036)的辅助在saRNA合成中必不可少。RNase Inhibitor可保护长片段的saRNA免受RNase的剪切。无机焦磷酸酶的适量使用可实现产量和完整性的平衡。

10Knt saRNA片段采用不同添加量无机焦磷酸酶转录结果。

03 DNA模板去除

IVT反应结束后,需要使用 DNase I去除 DNA 模板,以减少对后续反应的影响。近岸蛋白GMP级DNase I(目录号:GMP-E127)可有效消化双链DNA模板,而对RNA无影响。

DNase I 去除RNA样本中的DNA残留

04 报告基因saRNA

eGFP saRNA(目录号:MR301)转染不同细胞24h后成功表达。

Luciferase saRNA(目录号:MR302)转染不同细胞后成功表达。随着时间延长,表达强度高于mRNA。

 

05 RNA药物开发全流程解决方案
随着自复制框架和序列设计的不断筛选优化,合成工艺的进一步探索,伴随saRNA的各项技术壁垒也将会逐步打破,saRNA未来可期。
 
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