Cell Meter 活细胞Caspase 3/7结合检测试剂盒 绿色荧光 实验方案-自主发布-资讯-生物在线

Cell Meter 活细胞Caspase 3/7结合检测试剂盒 绿色荧光 实验方案

作者:西安百萤生物科技有限公司 2023-08-23T00:00 (访问量:11525)

有多种参数可用于检测细胞凋亡。这种Cell Meter 活细胞半胱天冬酶3/7活性测定试剂盒旨在通过测量活细胞中胱天蛋白酶3/7的活化来检测细胞凋亡。它用于定量凋亡细胞中活化的caspase 3/7活性,或用于筛选caspase 3/7抑制剂。TF3-DEVD-FMK,红色标记试剂,允许通过荧光显微镜,流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶3/7。该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。

适用仪器

流式细胞仪

 

参数

见表1


荧光显微镜

 

推荐孔板:

黑色透明

通道:

见表1


荧光酶标仪

 

推荐孔板:

黑色孔板

通道:

见表2

表1:用于流式细胞仪和荧光显微镜的荧光强度检测

 

流式细胞仪

荧光显微镜

FAM-DEVD-FMK

FL1 通道

FITC 通道

Propidium Iodide

FL2 通道

TRITC 通道

Hoechst Dye

紫色激光

DAPI 通道

表2:荧光酶标仪的荧光强度检测

 

激发

发射

cutoff

FAM-DEVD-FMK

FL1 通道

FITC 通道

515nm

Propidium Iodide

FL2 通道

TRITC 通道

 

Hoechst Dye

紫色激光

DAPI 通道

 

实验方案

分离细胞的检测方案

概述

用测试化合物制备细胞,密度为5×105至2×106个细胞/ mL

将TF3-DEVD-FMK以1:150的比例加入细胞溶液中

在室温下孵育1小时

沉淀细胞,用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞

在Ex / Em = 550 / 595nm处分析细胞

注:使用前将所有部件在室温下解冻。

 

操作方法

1.根据您的特异性诱导方案,将细胞培养至适于细胞凋亡诱导的密度,但不超过2 x 106个细胞/ mL。同时,对于每种标记条件,以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子:

1)用2μg/ ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。

2)用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。

3)用4μg/ ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。

4)用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。

注意:应对每个细胞系进行单独评估,以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。

2.通过向TF3-DEVD-FMK(组分A)的小瓶中加入50μLDMSO制备150X TF3-DEVD-FMK DMSO储备溶液。 将150×TF3-DEVD-FMK以1:150的比例加入细胞溶液中,并将细胞在37℃,5%CO2培养箱中孵育1小时。

注1:对于TF3-DEVD-FMK标记,细胞可以浓缩至~5×10 6个细胞/ mL。 未使用的150X TF3-DEVD-FMK DMSO储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20°C。

注2:对于粘附细胞,用0.5mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整,并在用TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。

注3:适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。

3.将细胞以约200g旋转5分钟,并用1mL洗涤缓冲液(组分B)洗涤细胞两次。 将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。

注1:TF3-DEVD-FMK是荧光的,因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。

注2:对于分离的细胞,应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中2-5×10 5个细胞/100μL等分试样,用于步骤5。

4.如果需要,用DNA染色标记细胞(例如用于死细胞的Nuclear Green DCS1,或用于细胞核染色的整个群体的Hoechst)。

5.通过荧光显微镜,流式细胞仪或荧光酶标仪在Ex / Em = 550/595 nm处检测荧光强度(对于Nuclear Green DCS1,Ex / Em = 490/525 nm,对于Hoechst染料,Ex / Em = 350/461 nm)

5.1对于流式细胞仪,使用Ex / Em = 550/595 nm(用于Nuclear Green DCS1染色的FL1通道)的通道监测荧光强度。

5.2用于荧光显微镜和荧光酶标仪。 将100μL细胞悬浮液置于96孔黑色微量滴定板的每个孔中。

注意:如果需要平衡细胞浓度,调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。 如果您的细胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失,则此调整步骤是可选的。

5.3使用TRITC通道(用于Nuclear Green DCS1染色的FITC通道,用于Hoechst染色的DAPI通道)在荧光显微镜下观察细胞。

5.4使用荧光酶标仪,使用Ex / Em = 550/595 nm(在570 nm处截止)底部读取模式监测荧光强度。

图示

  图1。用 Kit # 20100荧光法检测 Jurkat 细胞中活性半胱天冬酶3/7。细胞用1μM 星形孢素处理3小时(红色) ,而未处理的细胞用作对照(蓝色)。细胞与 FAM-devD-FMK 在37 °C 温育1小时。使用FlexStation 微板阅读器使用底部读取模式在 Ex/Em = 490/525nm (在515nm 处截止)测量荧光强度(300,000个细胞/100μL/孔)。

图2。使用 FAM-devD-FMK (目录号20100)荧光法检测 Jurkat 细胞中活性半胱天冬酶3/7。用1μM 星形孢菌素处理细胞4小时(红色) ,而未处理的细胞作为对照(绿色)。对照和处理的细胞与 FAM-devD-FMK 在37 °C 温育1小时,然后在染色后洗涤一次。用 NovoCyteTM 3000流式细胞仪 FITC 通道测量荧光强度。

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